Znajdujące się w zabytkowych zamojskich kamienicach muzeum gromadzi i prezentuje zabytki związane z historią miasta, obejmujące takie działy, jak archeologia, sztuka i etnografia. Na ekspozycjach stałych można obejrzeć między innymi bogatą kolekcję dzieł sztuki, numizmatów, rzeźby, dokumenty i starodruki oraz dziesiątki innych eksponatów.
Bogata kolekcja, jaką gromadzi i prezentuje Muzeum Zamojskie to zabytki pochodzące jeszcze z czasów pierwszych polskich królów. Można tu na przykład zobaczyć monety bite za czasów Władysława Jagiełły, ale również przestudiować dokumenty z okresu II wojny światowej. W kolekcji obrazów wyróżniają się portrety polskich królów nieznanych autorów, pochodzące z XVIII wieku.
Miłośnicy militariów mogą również zapoznać się z bogatą ekspozycją broni używanej na przestrzeni niemal tysiąca lat. Muzeum Zamojskie posiada też bogate zbiory biblioteczne, obejmujące szereg publikacji z XIX wieku i literaturę nowożytną tematycznie związaną z Zamościem.
Poza wystawami stałymi i czasowymi placówka prowadzi też działalność edukacyjną, organizuje Niedzielne Spotkania Muzealne i systematycznie rozszerza swoją kolekcję.